Ko'pgina viruslarning genomik ketma-ketligi ma'lum.Nuklein kislotasi problari DNKning qisqa segmentlari bo'lib, ular qo'shimcha virusli DNK yoki RNK segmentlari bilan gibridlanish uchun mo'ljallangan.Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) virusni aniqlashning yanada samarali usuli hisoblanadi.Yaqinda yuqori o'tkazuvchanlik diagnostika usullari ishlab chiqildi.
A. Nuklein kislotalarni duragaylash texnikasi
Nuklein kislotalarning gibridlanishi, asosan janubiy blot (Janubiy) va Shimoliy blot (Shimoliy) ni o'z ichiga olgan holda, virus diagnostikasi sohasida tez rivojlanayotgan yangi texnikadir.Gibridizatsiya tahlilining mantiqiy asosi qo'shimcha virusli DNK yoki RNK segmentlari bilan duragaylash uchun mo'ljallangan DNKning qisqa segmentlaridan ("zond" deb ataladi) foydalanishdir.Issiqlik yoki gidroksidi ishlov berish orqali ikki zanjirli maqsadli DNK yoki RNK bitta ipga bo'linadi va keyin qattiq tayanchda immobilizatsiya qilinadi.Shundan so'ng, zond qo'shiladi va maqsadli DNK yoki RNK bilan gibridlanadi.Zond izotop yoki radioaktiv bo'lmagan nuklid bilan etiketlanganligi sababli, maqsadli DNK yoki RNK avtoradiografiya yoki biotin-avidin tizimi orqali aniqlanishi mumkin.Virusli genomlarning aksariyati klonlangan va ketma-ketlashtirilganligi sababli, ularni namunadagi zondlar sifatida virusga xos ketma-ketliklar yordamida aniqlash mumkin.Hozirgi vaqtda duragaylash usullari quyidagilarni o'z ichiga oladi: nuqta blot , hujayralarda in situ gibridizatsiya , DNK blot (DNK) (Janubiy blot) va RNK blot (RNK) (Shimoliy blot).
B.PCR texnologiyasi
So'nggi yillarda sezgir bo'lmagan yoki etishtirilmaydigan viruslarni sinab ko'rish uchun PCR asosida nuklein kislotani in vitro kuchaytirish usullari ishlab chiqildi.PCR - bu in vitro polimeraza reaktsiyasi orqali o'ziga xos DNK ketma-ketligini sintez qila oladigan usul.PCR jarayoni uch bosqichdan iborat termal tsiklni o'z ichiga oladi: denatürasyon, tavlanish va uzaytirish Yuqori haroratda (93 ℃ ~ 95 ℃), ikki zanjirli DNK ikkita bitta DNK zanjiriga bo'linadi;keyin past haroratda (37 ℃ ~ 60 ℃), ikkita sintezlangan nukleotid primerlari qo'shimcha DNK segmentlariga tavlanadi;Taq fermenti uchun mos haroratda (72 ℃), yangi DNK zanjirlarining sintezi qo'shimcha DNKni shablon sifatida va bitta nukleotidlarni material sifatida ishlatgan holda 3-primerdan boshlanadi.Shunday qilib, har bir tsikldan keyin bitta DNK zanjiri ikkita zanjirga ko'paytirilishi mumkin.Ushbu jarayonni takrorlash, bir tsiklda sintez qilingan har bir DNK zanjiri keyingi tsiklda shablon sifatida ishlatilishi mumkin va har bir tsiklda DNK zanjirlari soni ikki baravar ko'payadi, ya'ni PCR ishlab chiqarish 2n log tezligida kuchayadi.25-30 tsikldan so'ng, PCR ishlab chiqarish elektroforez orqali aniqlanadi va o'ziga xos DNK mahsulotlarini UV nurida (254nm) kuzatish mumkin.O'ziga xoslik, sezgirlik va qulaylik afzalliklari uchun PCR HCV, OIV, CMV va HPV kabi ko'plab virusli infektsiyalarning klinik diagnostikasi uchun qabul qilingan.PCR juda sezgir bo'lganligi sababli, u virus DNKsini fg darajasida aniqlay oladi, noto'g'ri ijobiy natijaga yo'l qo'ymaslik uchun operatsiya juda ehtiyotkorlik bilan bajarilishi kerak.Bundan tashqari, nuklein kislotasi testining ijobiy natijasi namunada jonli yuqumli virus mavjudligini anglatmaydi.
PCR texnikasini keng qo'llash bilan turli xil sinov maqsadlari uchun PCR texnikasiga asoslangan yangi texnika va usullar ishlab chiqiladi.Masalan, real vaqtdagi miqdoriy PCR virus yukini aniqlay oladi;in situ PCR to'qima yoki hujayralardagi virus infektsiyasini aniqlash uchun ishlatiladi;Ichki PCR PCRning o'ziga xosligini oshirishi mumkin.Ular orasida real vaqtda miqdoriy PCR tezroq ishlab chiqilgan.TaqMan gidroliz zondi, gibridizatsiya zondi va molekulyar mayoq zondlari kabi ko'plab yangi texnikalar klinik tadqiqotlarda keng qo'llaniladigan real vaqtda kantitativ PCR texnikasiga birlashtirildi.Bemorning tana suyuqligidagi virusli yukni aniq aniqlashdan tashqari, bu usul dori-darmonlarga chidamli mutantni aniqlash uchun ham qo'llanilishi mumkin.Shu sababli, real vaqtda miqdoriy PCR asosan shifobaxsh ta'sirni baholash va dori bardoshlik nazoratida qo'llaniladi.
C. Virusli nuklein kislotalarning yuqori o'tkazuvchanligini aniqlash
Yangi paydo bo'ladigan yuqumli kasalliklarni tezkor tashxislash ehtiyojlarini qondirish uchun DNK chiplari (DNK) kabi turli xil yuqori o'tkazuvchanlikni aniqlash usullari o'rnatildi.DNK chiplari uchun maxsus zondlar sintezlanadi va namuna bilan gibridlanishi mumkin bo'lgan DNK prob mikroarrayini (DNK) hosil qilish uchun juda yuqori zichlikdagi kichik kremniy chiplariga biriktiriladi.Gibridlanish signali konfokal mikroskop yoki lazerli skaner yordamida tasvirlanishi va kompyuterda keyinchalik qayta ishlanishi va turli genlarga tegishli katta ma'lumotlar to'plamini olish mumkin.Ikki xil DNK chiplari mavjud."Sintez chipi" quyidagicha: o'ziga xos oligonükleotidlar to'g'ridan-to'g'ri chiplarda sintezlanadi.Yana biri DNK hovuz chipi.Klonlangan genlar yoki PCR mahsulotlari slaydda tartibda chop etiladi.DNK chip texnologiyasining afzalligi bir vaqtning o'zida juda ko'p miqdordagi DNK ketma-ketligini aniqlashdir.Patogenni aniqlash chipining so'nggi versiyasi bir vaqtning o'zida 1700 dan ortiq odam viruslarini aniqlay oladi.DNK chip texnologiyasi an'anaviy nuklein kislota gibridizatsiya usullari muammolarini hal qildi va virus diagnostikasi va epidemiologik o'rganishda juda keng qo'llaniladi.
Yuborilgan vaqt: 23-dekabr 2020-yil